PEWARNAAN BAKTERI

Tujuan

1. Untuk mengetahui teknik pewarnaan bakteri dengan cara pengecatan negatif, pengecatan sederhana dan pengecatan gram.

2. Untuk mengetahui bentuk morfologi bakteri

Pendahuluan

Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994).

Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna khusus diperlukan untuk melihat bentuk kapsul ataupun flagella, dan hal-hal terperinci tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, yang salah satu diantaranya berwarna (Volk dan Whleer, 1998).

Banyak senyawa organik berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopik dan telah dikembangkan prosedur pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985) :

· Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar.

· Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme.

· Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa.

Langkah-langkah utama dalam persiapan spesimen mikroba untuk pemeriksaan mikroskopik adalah (Pelczar, 1986) :

· Penempatan olesan atau lapisan spesimen pada kaca objek.

· Fiksasi olesan pada kaca objek.

· Aplikasi pewarna tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan pewarna atau reagen (pewarnaan diferensial.

Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba, banyak dilakukan baik secara langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni). Tujuan dari pewarnaan tersebut adalah pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985) :

· Mempermudah melihat bentuk jasad baik bakteri, ragi ataupun fungi.

· Memperjelas ukuran dan bentuk jasad

· Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.

· Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik dan kimia yang ada akan dapat diketahui.

Pewarna yang digunakan pada umumnya berbentuk senyawa kimia khusus yang akan memberikan reaksi kalu mengenai bagian tubuh jasad. Karena pewarnaan tersebut berbentuk ion yang bermuatan positif ataupun negative. Sel bakteri bermuatan mendekati negatif kalau dalam keadaan pH mendekati netral. Sehingga kalau kita memberikan pewarnaan yang bermuatan positif ataupun negatif (Suriawiria, 1985).

Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Disebut demikian karena hanya digunakan satu jenis cat pewarna untuk mewarnai organisme. Kebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofil (suka akan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromofornya bersifat positif). Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (coccus, vibrio, basillus, dsb) dari bahan-bahan lainnya yang ada pasa olesan yang diwarnai (Hadiotomo, 1990). Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya (Campbell dan Reece, 2005)

Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina (Hadiotomo, 1990).

Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bilakomponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar. Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop cahaya terang biasa karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri, walaupun biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna. Bakteri sering diamati dalam keadaan olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup. Yang dimaksud dengan bakteri terwarnai adalah oganisme yang telah diwarnai dengan zat pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari (Volk dan Whleer, 1998).

Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu (Hadiotomo, 1990) :

· Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.

· Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat.

· Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

· Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.

· Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.

· Tidak resisten terhadap gangguan fisik.

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu (Hadiotomo, 1990) :

· Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.

· Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.

· Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

· Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.

· Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.

· Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu (Volk & Wesley, 1998):

1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.

2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.

3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.

4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin

Pembahasan

Pengecatan sederhana digunakan untuk memperlihatkan atau memperjelas kontras antara sel dan latar belakangnya sehingga dapat mempertajam bentuk dari sel-sel mikroba itu sendiri, dengan cara mewarnai sel-sel mikroba dengan zat warna khususnya warna Kristal violet. Pada pengecatan sederhana digunakan bakteri Bacillus cereus dan Salmonella typii. Setelah pengecatan diperoleh bakteri tersebut berwarna ungu, yang berarti bakteri tersebut menyerap zat warna cat tersebut sehingga Nampak pada mikroskop. Zat warna yang umunya digunakan yakni yang bersifat alkalin (kromatofornya bermuatan +).

Pada pengecatan ini digunakan cat asam nirosin (tinta cina). Pengecatan ini dilakukan untuk mewarnai latar belakang preparat sedangkan bakteri sendiri tidak terwarnai serta untuk mengamati ukuran, bentuk, dan tata letak sel. Setelah pengamatan dibawah mikroskop diperoleh preparat mikroba berwarna hitam sedangkan bakteri sendiri tidak berwarna (berwarna putih) dan berbentuk basil (batang).

Pengecatan gram termasuk pengecatan diferensial yang digunakan untuk membedakan bakteri gram negative dan bakteri gram positif. Pada pengecatan ini digunakan . Pengecatan ini menggunakan 4 jenis larutan yaitu Kristal violet sebagai cat utama, larutan iodine sebagai pengintensifan cat utama, alcohol asam untuk pencucian dan safranin sebagai cat penutup. Berdasarkan percobaan diperoleh Bacillus cereus dan Salmonella typii bersifat gram positif yang berarti bakteri dapat mengikat dengan kuat cat utama cristal violet berwarna ungu, pada saat bakteri Gram positif ditambahkan dengan kristal violet maka gram positif akan mengabsorbsi larutan tersebut hanya pada dinding sel, dengan pemberian larutan lugol maka kristal violet akan masuk sampai ke inti sel, pemberian alkohol menyebabkan pori-pori dinding sel mengecil sehingga warna ungu tertahan di dalam sel disebabkan oleh rendahnya kandungan lipid. Sedangkan bakteri Eschericia coli bersifat gram negative karena tidak dapat mengikat kuat cat utama dan dapat diwarnai oleh cat lawan yakni merah dari pewarna safranin.

Kesimpulan

Berdasarkan percobaan yang dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa :

- Pewarnaan mikroorganisme dapat dilakukan dengan cara yaitu dengan pengecatan gram, pengecatan sederhana dan pengecatan negative.

- Pewarnaan sederhana digunakan untuk melihat bentuk dan struktur sel bakteri dengan menggunakan satu jenis pewarna seperti safranin atau kristal violet, pewarnaan gram digunakan untuk membedakan antara bakteri gram (+) dan gram (-) dengan lebih dari satu zat warna sedangkan pewarnaan negative berguna untuk mewarnai latar belakang preparat dan bakteri sendiri tidak terwarnai.

- Bakteri gram negatif pada teknik pewarnaan akan menghasilkan warna merah dan bakteri gram positif akan menghasilkan warna ungu.

Daftar Pustaka

Campbell, N. A. Dan Reece, J. B., 2005. Biologi Jilid 2. Erlangga. Jakarta.

Dwidjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan.

Hadiotomo, Ratna Siri., 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Pt Gramedia.

Lay, Bibiana W. dan Sugyo Hastowo. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: Raja grafindo persada.

Pelczar, M. W., 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi 1. UI Press. Jakarta.

Suriawiria, U., 1985. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.

Volk, Wesley A dan Margareth F. Wheeler., 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta : Erlangga.

STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIA

1. Sterilisasi

Sterilisasi dalam mikrobiologi ialah suatu proses untuk mematikan semua organism yang teradapat pada suatu benda. Proses sterilisasi dapat dibedakan menjadi 3 macam, yaitu penggunaan panas (pemijaran dan udara panas); penyaringan; penggunaan bahan kimia (etilena oksida, asam perasetat, formaldehida dan glutaraldehida alkalin) (Hadioetomo, 1993).

Sterilisasi yang umum dilakukan dapat berupa:

a. Sterilisasi secara fisik (pemanasan, penggunaan sinar gelombang pendek yang dapat dilakukan selama senyawa kimia yang akan disterilkan tidak akan berubah atau terurai akibat temperatur atau tekanan tinggi). Dengan udara panas, dipergunakan alat “bejana/ruang panas” (oven dengan temperatur 170^o – 180^oC dan waktu yang digunakan adalah 2 jam yang umumnya untuk peralatan gelas).

b. Sterilisasi secara kimia (misalnya dengan penggunaan disinfektan, larutan alkohol, larutan formalin).

c. Sterilisasi secara mekanik, digunakan untuk beberapa bahan yang akibat pemanasan tinggi atau tekanan tinggi akan mengalami perubahan, misalnya adalah dengan saringan/filter. Sistem kerja filter, seperti pada saringan lain adalah melakukan seleksi terhadap partikel-partikel yang lewat (dalam hal ini adalah mikroba) (Suriawiria, 2005).

Autoklaf digunakan sebagai alat sterilisasi uap dengan tekanan tinggi. Penggunaan autoklaf untuk sterilisasi, tutupnya jangan diletakkan sembarangan dan dibuka-buka karena isi botol atau tempat medium akan meluap dan hanya boleh dibuka ketika manometer menunjukkan angka 0 serta dilakukan pendinginan sedikit demi sedikit. Medium yang mengandung vitamin, gelatin atau gula, maka setelah sterilisasi medium harus segera didinginkan. Cara ini untuk menghindari zat tersebut terurai. Medium dapat langsung disimpan di lemasi es jika medium sudah dapat dipastikan steril (Dwidjoseputro, 1994).

2. Pembuatan Media

Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangkan pada suatu substrat yang disebut medium. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan mikroorganisme tersebut harus sesuai susunanya dengan kebutuhan jenis-jenis mikroorganisme yang bersangkutan. Mikroorganisme yang ingin kita tumbuhkan, yang pertama harus dilakukan adalah memahami kebutuhan dasarnya kemudian memformulasikan suatu medium atau bahan yang akan digunakan. Air sangat penting bagi organisme bersel tunggal sebagai komponen utama protoplasmanya serta untuk masuknya nutrien ke dalam sel. Pembuatan medium sebaiknya menggunakan air suling. Air sadah umumnya mengandung ion kalsium dan magnesium yang tinggi. Pada medium yang mengandung pepton dan ektrak daging, air dengan kualitas air sadah sudah dapat menyebabkan terbentuknya endapan fosfat dan magnesium fosfat (Hadioetomo, 1993). Untuk mendukung pertumbuhan mikroba, sebuah media harus menyediakan sumber energi seperti karbon, nitrogen, fosfor, sulfur, dan bahan organik lainnya. Media kimia diartikan salah satu media yang menggunakan bahan kimia yang telah diketahui (Tortora, 2002). Pada pembuatan media untuk berbagai macam organisme harus menggunakan bahan yang mengandung banyak protein dangan berbagai konsentrasinya sehingga dapat menumbuhkan bakteri (Stanier, 2001). Agar-agar merupakan kompleks polisakarida,dihasilkan oleh alga laut dan digunakan untuk pemadat pada makanan. Keunggulan agar yaitu mencair pada suhuy yang sama dengan air, namun tetap dalam keadaan cair sampain suhu 40 0C ( Suryanto dan Munir, 2006).

PH merupakan faktor yang sangat mempengaruhi suatu keberhasilan dalam pembuatan medium sehingga kondisi pH yang terlalu basa atau terlalu asam tidak cocok untuk dijadikan medium mikroba karena mikroba tidak dapat hidup pada kondisi tersebut. Medium didiamkan atau disimpan selama 2 x 24 jam untuk menyakinkan bahwa medium masih steril, karena selain pH sebagai penentu tumbuhnya mikroba, alat dan medium yang steril juga menentukan (Dwidjoseputro, 1994).

Pembuatan medium Potato Dextrose Agar (PDA), kentang sudah ditimbang dan direbus, dengan ukuran kentang 50,31 g dan agar 4,03 g. Disini menggunakan agar untuk mengentalkan medium. Ekstrak kentang dan agar disetir dan diatur suhu dan pHnya. Sebelum dilakukan sterilisasi, medium berawarna kuning, setelah disterilisasi dalam autoklaf medium berwarna kecoklatan dan didapat endapan berwarna putih. Setelah didinginkan beberapa saat, medium dapat ditanami bakteri (Schegel, 1993).

Pembuatan medium Nutrien Agar (NA) menggunakan bahan utama beef ekstrak 5 g, peptom 3 g dan agar 3 g. Pada awal pengamatan medium Nutrien Agar, sebelum proses sterilisasi berwarna kuning, setelah sterilisasi warna medium menjadi agak coklat. Pada pembuatan medium NA ini ditambahkan pepton agar mikroba cepat tumbuh, karena mengandung banyak N₂ (Dwidjoseputro, 1994). Agar yang digunakan dalam proses ini untuk mengentalkan medium sama halnya dengan yang digunakan pada medium PDA yang juga berperan sebagai media tumbuh yang ideal bagi mikroba (Schlegel, 1993).

Daftar Pustaka

Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta.

Hadioetomo, R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia, Jakarta.

Schegel, G.H. 1993. General Microbiologi seventh edition. Cambrige University Press, USA.

Stanier, Y. R. Dkk. 2001. The Microbial World. Prenticel Hall. Inc. EigleWood. New Jersey.

Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti, Jakarta.

Suryanto, D. dan E. Munir. 2006. Bahan Ajar : Mikrobiologi. USU-Press, Medan.

Tortora, G. J., B. R. Funke, and C. L. Case. 2002. Microbiology : An Introduction. Addison Wesley Longman, New York.

Volk, W. A. dan M. F. Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar, Erlangga, Jakarta